脾臟是機(jī)體重要的免疫器官之一，含有大量的淋巴細(xì)胞，占全身淋巴組織總量的25%，在小鼠中，由于小鼠血液量少，從外周血液中分離大量淋巴細(xì)胞較為困難，故經(jīng)常需要從其脾臟中獲取大量的淋巴細(xì)胞。

不久前，來(lái)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院的李老師在Biomaterials雜志上發(fā)布的文章中就用到了上述實(shí)驗(yàn)。以下為是李老師分享的一些相關(guān)經(jīng)驗(yàn)。

操作步驟

1 材料準(zhǔn)備

選取具有正常免疫功能的成年小鼠（所需的小鼠數(shù)量根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定，通常一只小鼠脾臟可提取的淋巴細(xì)胞數(shù)量為2~6×10⁷），快速斷頸處死(避免脾梗死)后，浸泡于75%酒精中；準(zhǔn)備好已消毒的眼科剪、眼科鑷，以及一個(gè)裝有一定量PBS的無(wú)菌皿，分離脾臟后置于皿中，全程無(wú)菌操作；

2 小鼠脾臟處理

脾臟細(xì)胞數(shù)量較少時(shí)，可用兩個(gè)1mL無(wú)菌注射器的針尖將脾臟戳出大量的空洞后，輕輕刮取脾臟表面，將脾臟細(xì)胞刮出；數(shù)量較多時(shí)，可用細(xì)胞濾網(wǎng)進(jìn)行研磨后離心，也可得到淋巴細(xì)胞。

3 離心

15mL離心管中吸入5mL ficoll分離液，傾斜管身，小心吸取含淋巴細(xì)胞的PBS緩慢加入ficoll分離液，可見(jiàn)明顯液體分層。600rpm梯度離心25分鐘，升速/降速均為2；

4 二次離心

得到分為3層的液體, 小心吸取中間層液體（含淋巴細(xì)胞+紅細(xì)胞）并置于新的15mL離心管，補(bǔ)滿PBS，600rpm離心5分鐘；

5 三次離心

棄上清PBS, 可見(jiàn)黑紅色沉淀，加入1~2mL紅細(xì)胞裂解液，冰上裂解5分鐘，補(bǔ)滿PBS, 600rpm離心5分鐘；

6 獲取淋巴細(xì)胞

棄上清PBS, 可見(jiàn)白色沉淀，此為總淋巴細(xì)胞；計(jì)數(shù)；

7 重懸淋巴細(xì)胞

將提前過(guò)夜包被CD3抗體(包被濃度為5ug/mL)的96孔板中的PBS吸棄，配制淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，1640全培+巰基乙醇+CD28抗體(終濃度2.5ug/mL)，重懸淋巴細(xì)胞并加入96孔板，100~200ul/孔，通常淋巴細(xì)胞數(shù)量為1~3×10⁵個(gè)/孔。通常8個(gè)小時(shí)即可看到T細(xì)胞增殖團(tuán)，刺激48h后可以較好活化T淋巴細(xì)胞；

8 分選

若實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑榉诌xCD4/CD8 T淋巴細(xì)胞，可以省去紅細(xì)胞裂解操作，直接用磁珠抗體對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行避光孵育，并用PBS洗掉多余的試劑后，棄上清，用一定量PBS重懸淋巴細(xì)胞，緩慢加入預(yù)先潤(rùn)濕過(guò)的macs tube(已安裝到磁力架上)。根據(jù)具體試劑和目的可以分為陰選和陽(yáng)選：陰選需要從分選柱中流下的液體，其中含有目的細(xì)胞；陽(yáng)選則應(yīng)該等待分選柱中的液體流盡后，將分選柱從磁力架上取下后，并重新加入PBS將分選柱中的陽(yáng)選細(xì)胞沖下，其中含有目的細(xì)胞。計(jì)數(shù)，此后步驟同總淋巴細(xì)胞。

注意事項(xiàng)

1   由于整個(gè)過(guò)程需要淋巴細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處于體外PBS中，所以對(duì)PBS的要求比較嚴(yán)格；為保護(hù)淋巴細(xì)胞，也可以使用專門的淋巴細(xì)胞緩沖液，或自行配制含0.4%BSA的PBS緩沖液；

2   有些研究為了更好地促進(jìn)淋巴細(xì)胞的殺傷功能，還會(huì)在T細(xì)胞培養(yǎng)基中添加IL-2; 但是，很多人認(rèn)為這樣也會(huì)加速T細(xì)胞進(jìn)入T細(xì)胞耗竭的進(jìn)程，同時(shí)會(huì)縮短T細(xì)胞壽命；

3   若后續(xù)需要進(jìn)行流式分析，無(wú)法再染CD3 和 CD28分子；

4   若用到了OT-I CD8 T細(xì)胞，則無(wú)需CD3抗體刺激，而是用OVA抗原刺激活化第一信號(hào)；

5   以上所有操作均以無(wú)菌試劑、耗材，無(wú)菌環(huán)境內(nèi)操作為前提。

 
以上為淋巴細(xì)胞提取、分選的經(jīng)驗(yàn)分享，希望對(duì)大家有所幫助。同時(shí)也歡迎更多老師參與文獻(xiàn)獎(jiǎng)勵(lì)活動(dòng)，分享您的科研干貨和心得體會(huì)！